Situata nel Palazzo dei Priori, è la collezione più importante per la conoscenza dell'arte umbra, di cui permette di seguire l'evoluzione dal Duecento al tardo Settecento. Vi sono raccolte opere di Duccio, Fra Angelico, Piero della Francesca, Pietro da Cortona, e, naturalmente, dei due grandi maestri umbri, Pinturicchio e il Perugino, nonché gli originali delle statuette in marmo di Nicola e Giovanni Pisano provenienti dalla Fontana Maggiore.